生物材料和细胞共培养步骤以及一些注意事项

个人经验和意见，可以根据实际情况补充完善

材料体内/体外/吃？应用场景不同材料选取本身应该已经考虑到毒性问题。

应用动物整体，直接作用，对材料量要求需要考虑但相对没有那么严苛，但是细胞层面==要求比较严苛。

 材料成分及其生物作用确认——探索材料需要加入的量：

(1) 假设材料成分理论释放为20-100%（释放太少材料的意义就体现不出来），那么需要在1ml培养基里面加多少材料才能到达起到生物作用的浓度？

(2) 假设成分释放已经做了，你就有具体释放值，根据这个值按照材料成分的工作浓度范围做需要做个梯度。

(3) 一段时间内最高释放出的材料是否对细胞有影响也需要考虑进去。

注：细胞需要培养基里面血清和营养物质生长，放一大坨材料，细胞生长环境和生存空间就被影响了。

 材料成分释放确认——筛选出有生物作用且无毒性的材料加入量的范围：

(1) 假设材料成分理论释放为20-100%（释放太少材料的意义就体现不出来），那么需要在1ml培养基里面加多少材料才能到达起到生物作用的浓度？

(2) 假设成分释放已经做了，你就有具体释放值，根据这个值按照材料成分的工作浓度范围做需要做个梯度。

(3) 一段时间内最高释放出的材料是否对细胞有影响也需要考虑进去。

 材料成分对材料整体结构的影响——排除结构对成分释放导致对细胞毒性/功能的影响/排除结构本身功能性作用：

(1) 如果这个成分对材料本身结构影响比较大，这里需要考虑这个结构对细胞毒性/生物功能是否有影响。

(2) 如果这个成分在材料里面设置了浓度梯度，该结构导致材料成分改变影响了材料成分的生物作用的工作浓度范围，那么细胞毒性实验具体加的材料量也需要单独设置一下梯度排除这种影响。

 材料加入量比较大——1ml培养基里面都需要加1/1-1/10的材料时候才能达到材料成分的生物作用的工作浓度范围

(1) 材料本体生物相容性很好，细胞不死，细胞生存空间会被影响，比如你材料放下去直接占孔板一半，那么你材料上是否能让细胞生长？后续能否抵消材料上面的细胞对结果的影响？后续其他实验是否会影响细胞量，比如提RNA/蛋白对细胞量要求比较多。如果能获取材料上的细胞还好，不能的话就要考虑浸提液或者其他方法。

(2) 材料本体生物相容性没那么好，那加这个量细胞死亡概率比较大，那可能考虑浸提液或者其他方法。 注意：材料如果是为了达到缓释的话，细胞毒性做一个至少3天的更有说服力，3天材料一直放到细胞里面最高释放也要考虑，加太多材料释放太高会不会有毒？这里可以根据成分的工作浓度来考虑材料的量。

 材料成分被缓释——其他功能性实验验证（基于前面已经筛选出的无毒且有生物功能的材料量的加入）

 抗菌： 一般细菌量104-108 CFU/mL，和材料在液体培养基培养一定时间后涂板/拍SEM/活死染（活死染的时候不要完全按照说明书稀释太低，拍共聚焦会很稀疏不好看），材料加多了肯定利于抗菌，但是和生物部分保持一致可能更好说明问题，建议设置个梯度。共培养具体时间8-24 h，可能需要探索一下，取决于材料的抗菌性，如果抗菌性很好可能很短时间内细菌会死完，但是如果为了体现组别差异，不能都死完，所以可以取不同时间点看那个时间点那组材料效果最好。具体时间，菌量需要根据不同实验查阅相关文献确认一下。

 抗炎：RAW264.7，直接吹打/细胞刮片传代，吹打均匀接板。

(1) PCR/WB： 抗炎一般是RAW264.7，我是材料和100ng/mL的LPS一起和50-80%的密度细胞加到6孔板，培养24h后细胞长满做提RNA和蛋白做PCR/WB。该实验对细胞量要求比较高，尽量提蛋白/RNA的时候量能达到80-100%

(2) 荧光/ROS： 100ng/mL的LPS一起和30-40%的密度细胞加到24共聚焦孔板，24h后密度达到60-80%处理后染荧光，动作轻柔，避免细胞漂起来，这里拍照的时候密度不能太满，不然一坨一坨不好看，太少也不好看。时间也不决定，我觉得24-48h都可以，根据细胞生长状态调整。

注：也可以细胞贴壁之后再加材料和LPS（LPS和材料也可以分开加），具体看细胞情况，RAW264.7半贴半悬容易漂，我个人觉得要不一起加了能贴就贴回去，不能的话多次刺激也不好。我喜欢一起加是因为省事的同时刺激会少几次，能成功就成功，不行就重新接，细胞好养，因为材料感觉会影响细胞粘附，如果细胞本身很圆，就特别容易漂。

 成血管HUVEC： 这个细胞好养，贴壁比较好，但是养久了容易老化，成管实验：一般是和材料培养4，6，8h拍照，一天就做完了，细胞密度适中，太低了太高了好像都不容易成管。至于PCR/WB/荧光的时间节点可以参考文献选取，没有特别注意的。

 成骨-rBMSCs： rBMSC很好养也很好做，我个人觉得比MC3T3好做，只要细胞提出来了后续都好做。

(1) WB/PCR： 6孔板做，对rBMSC代数要求不高，P2-P5都可以（提的时候是P0代，胰酶消化一次加一代），材料和细胞培养3，7，14天都可以，中途换液问题如果材料成分是缓释的，比如成骨需要7天，14天等，如果材料缓释能到14天且材料不降解，中途可以考虑不更换材料只更换培养基，如果材料不能，那可以考虑和培养基一起更换，不然材料生物作用可能有影响，但是不排除只要材料作用后，没有材料细胞的功能影响也可以持续。

(2) 测序： 6孔板做，PCR验证两个成骨基因确实上调后再送，不然容易没有差异，时间可以设置一个梯度，比如3天，7天等。

(3) 荧光： 这里看细胞骨架啥的，我觉得密度拍照时50-80%就可以了，不然不好看。容易挤到一堆，时间可以选24，48，72h看早期对rBMSC影响。

(4) ALP： 24孔板做，代数P2-P4代都可以，这个很好做，因为只有7天，细胞密度一致的情况按照步骤诱导染色就可以。

(5) ARS： 24孔板做，这里最好用代数比较靠前的比如P2-P3代比较好做，一般14-21天，状态好的情况下7-10天就有钙结节。因为钙结节不好形成，又担心脱膜的问题，我换液有时候喜欢半换液，除了减少刺激避免脱膜，我觉得rBMSC成骨过程可能分泌了很多因子是利于成骨的，所以可能ARS过程中半换液一次然后全换液一次交替来。